Принцип работы ПЦР-амплификатора — устройство, применение и особенности технологии

Полимеразная цепная реакция (ПЦР ) – это технология, используемая для увеличения количества ДНК в определенном образце. Она была разработана Кари Муллисом в 1983 году и с тех пор стала основным инструментом в молекулярной биологии и генетике.

Принцип работы ПЦР амплификатора основан на циклическом повторении трех этапов: денатурации, отжига и продления. Во время денатурации двуцепочечной ДНК ее две спиральные цепи разделяются, образуя два отдельных одноцепочечных молекулы. Этот процесс происходит при высокой температуре (около 95°C), когда связи между нуклеотидами распадаются.

Затем происходит отжиг – понижение температуры до около 50-65°C. В этом диапазоне определенные связывающие пробы, называемые праймерами, связываются с определенными участками ДНК. Праймеры являются короткими одноцепочечными фрагментами ДНК, которые содержат последовательность нуклеотидов, специфичную для конкретного участка ДНК, который нужно увеличить.

Завершающим этапом является продление – повышение температуры до 72°C. При этой температуре фермент ДНК-полимераза добавляет новые нуклеотиды к каждой одноцепочечной ДНК, используя праймеры в качестве заготовок. Таким образом, образуется новая двуцепочечная молекула ДНК. После каждого цикла удваивается количество ДНК в образце, что приводит к экспоненциальному увеличению количества фрагментов ДНК.

Принцип работы ПЦР амплификатора

Работа ПЦР амплификатора состоит из трех основных шагов: денатурации, отжиг (примерка) и продление (экстенсия).

• Денатурация: В этом шаге образец ДНК, содержащий целевой участок, нагревается до высокой температуры (обычно около 95°C) для разделения двух комплементарных цепей ДНК друг от друга. Это происходит благодаря разрушению водородных связей между нуклеотидами.
• Отжиг: После денатурации образец охлаждается до более низкой температуры (обычно около 50-60°C). В этой фазе добавляются специфические праймеры, которые подходят к области интереса на матричной ДНК для начала синтеза новой цепи ДНК.
• Продление: При повышении температуры до оптимального значения для действия ДНК-полимеразы (обычно около 72°C), она начинает синтезировать новую цепь ДНК, используя праймеры в качестве стартовой точки. Таким образом, в результате каждого цикла ПЦР количество целевой ДНК удваивается.

Этот трехшаговый цикл повторяется несколько раз (обычно 20-40 циклов), чтобы значительно увеличить количество исходной ДНК, что делает возможным обнаружение и изучение редких и трудно обнаруживаемых участков ДНК.

Описание и цель метода

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) используется для внезапного увеличения определенного фрагмента ДНК. Он играет важную роль в современной молекулярной биологии и имеет множество приложений, от идентификации генетических характеристик до диагностики инфекций и исследования эволюции.

Основная цель ПЦР-амплификации состоит в получении большого количества копий конкретного фрагмента ДНК из первоначальной матрицы ДНК. Это делается путем последовательного повторения циклов нагревания, охлаждения и синтеза ДНК под воздействием ТАК-полимеразы.

Метод ПЦР основан на клеточном процессе репликации ДНК, который происходит в природе. Однако, в отличие от естественной репликации, ПЦР можно контролировать и расширять в большом количестве.

Для успешной реакции ПЦР требуется первоначальная матрица ДНК, две короткие однонитевые последовательности ДНК, так называемые праймеры, которые инициируют реакцию, разные нуклеотиды (A, T, C, G) в виде диДТФ-мономеров, а также ТАК-полимераза, которая синтезирует новые цепи ДНК.

Сначала происходит разделение двух цепей ДНК, которые будут использоваться в качестве матрицы, при нагревании в термоцикле. Затем праймеры связываются с отдельными разделенными цепями ДНК, что обеспечивает точное начало синтеза новой цепи ДНК. При охлаждении ТАК-полимераза добавляет нуклеотиды (диДТФ-мономеры) к праймерам, образуя новые цепи ДНК. Этот цикл повторяется несколько раз, чтобы увеличить количество копий исходного фрагмента ДНК.

Итак, ПЦР-амплификация позволяет увеличить количество определенных фрагментов ДНК, что делает их легкими для дальнейшего анализа. Метод прост в использовании, весь процесс может быть автоматизирован, и результаты могут быть получены в течение нескольких часов. ПЦР стал одним из основных методов молекулярной биологии и имеет широкий спектр применения в научных и медицинских исследованиях.

Шаги проведения ПЦР

Шаги проведения ПЦР обычно включают:

1. Денатурация: Нагревание образца ДНК для отделения двух цепочек ДНК друг от друга.
2. Отжиг: Охлаждение образца ДНК, чтобы позволить праймерам (коротким фрагментам ДНК, которые служат инициаторами усиления) связаться с целевой последовательностью.
3. Экстензия: При добавлении ДНК-полимеразы и нуклеотидов начинается усиление целевой последовательности ДНК.
4. Цикл повторяется: Все шаги повторяются несколько раз (обычно 20-40 раз), чтобы получить значительное увеличение числа ДНК-копий.

После проведения ПЦР полученные копии ДНК могут быть подвергнуты дальнейшему исследованию, такому как секвенирование, рестрикционный анализ или анализ методом гибридизации.

Денатурация ДНК

ДНК состоит из двух комплементарных цепей, которые образуют водородные связи между собой. В процессе денатурации эти водородные связи разрушаются и цепи разделяются. Одноцепочечные фрагменты ДНК имеют энергетически более выгодное положение, поэтому процесс денатурации является эндотермическим и требует энергии.

Высокая температура является одним из наиболее распространенных методов денатурации ДНК. При нагревании ДНК до определенной температуры (обычно около 95°C) происходит разделение двухцепочечной структуры на две одноцепочечные. Под действием высокой температуры водородные связи между комплементарными нуклеотидами разрываются, и цепи становятся свободными.

Изменение pH также может быть использовано для денатурации ДНК. В кислой среде происходит разрушение водородных связей, что приводит к разделению двухцепочечной структуры ДНК.

Для усиления процесса денатурации ДНК могут добавляться химические вещества, такие как гуанидин тиоцианат и диметилсульфоксид (DMSO). Эти вещества обладают высокой способностью разрушать водородные связи, что ускоряет процесс денатурации.

Прикрепление праймеров

Процесс прикрепления праймеров начинается с нагревания образца ДНК до высокой температуры (около 95 °C). При такой температуре две цепи образца разделяются, распадая двойную спираль ДНК на две отдельные цепи. Этот шаг называется денатурацией.

После денатурации, образец ДНК охлаждается до температуры, при которой праймеры могут связаться с целевыми участками ДНК. Это температура обычно составляет около 55-65 °C. На этом этапе праймеры связываются с соответствующими участками образца ДНК и становятся их точками инициации.

Затем, при повышении температуры до около 72 °C (оптимальной для активности Термус термофильной ДНК-полимеразы), ПЦР амплификатор запускает процесс синтеза новой ДНК. Термус термофильная ДНК-полимераза использует праймеры в качестве стартовых точек для синтеза новых нитей ДНК. На каждом цикле ПЦР амплификации количество скопированной ДНК удваивается.

Таким образом, прикрепление праймеров играет важную роль в процессе ПЦР амплификации, обеспечивая специфическую связь с целевыми участками ДНК и инициируя синтез новой ДНК. Этот этап является одним из критических моментов в проведении ПЦР амплификации и требует точного подбора праймеров для достижения оптимальных результатов.

Экстенсия и синтез ДНК

В процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификатор используется для экстенсии и синтеза ДНК. Этот аппарат обеспечивает термоконтроль и регуляцию температуры для проведения реакции.

Экстенсия ДНК — это процесс удлинения и увеличения количества ДНК в пробе с использованием термостабильной ДНК-полимеразы. Во время ПЦР амплификации, когда пробы ДНК подвергаются нагреванию до высокой температуры, две отдельные цепи ДНК разделяются на две одноцепочечные молекулы. Затем при понижении температуры к действующим условиям ПЦР, отжигу, праймеры связываются с отдельными цепями ДНК.

Полимеразная цепная реакция осуществляется при использовании термостабильной ДНК-полимеразы (обычно термоустойчивой полимеразы из видов Thermus aquaticus и Thermus thermophilus). Эта ДНК-полимераза способна работать при очень высоких температурах, что позволяет проводить циклы нагревания и охлаждения во время ПЦР.

Синтез ДНК — это процесс, при котором термостабильная ДНК-полимераза считывает основание одной цепи ДНК и добавляет комплементарные основания для образования новой, полной двухцепочечной молекулы ДНК. Этот процесс осуществляется через несколько температурных циклов, которые называются циклами ПЦР. Каждый цикл включает нагревание пробы до высокой температуры для разделения двунитевой ДНК на однонитевые молекулы, затем охлаждение для связывания праймеров с отдельными цепями ДНК, и наконец, нагревание для активации ДНК-полимеразы и синтеза новой цепи ДНК.

Таким образом, экстенсия и синтез ДНК являются важными этапами ПЦР, которые способствуют увеличению количества и размножению нужного фрагмента ДНК.

Охлаждение и повторение цикла

После охлаждения происходит повторение цикла нагревания, охлаждения и аннелирования. Количество повторений цикла определяется требуемым количеством амплифицируемой ДНК. Каждый цикл включает в себя нагревание смеси до определенной температуры, охлаждение и аннелирование праймеров с ДНК. В результате каждого цикла количество амплифицированной ДНК удваивается, что позволяет получать значительное увеличение исходной ДНК-последовательности.

Такие повторения циклов позволяют получить множество копий искомой ДНК-последовательности, амплифицируя ее экспоненциально. Количество циклов может варьироваться в зависимости от требуемого количества ДНК для анализа или диагностики. После завершения последнего цикла амплифицированная ДНК готова к дальнейшим этапам анализа или использования в различных приложениях биотехнологии.